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PCR反應條件控制
日期：2025-06-01 23:09
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摘要：
PCR反應條件控制：
1、PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2、鎂離子濃度總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3、底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 μmol/L。
4、TaqDNA聚合酶2.5U(100 μl）。
5、引物濃度一般為0.1 ～0.5 μmol/L。
6、反應溫度
a. 變性溫度和時間95℃，30s。
b. 退火溫度和時間 低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃。
c. 延伸溫度和時間72℃，1 min/kb(10 kb內）。
d. Tm值=4(G+C) +2(A+T...
PCR反應條件控制：
1、PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2、鎂離子濃度總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3、底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 μmol/L。
4、TaqDNA聚合酶2.5U(100 μl）。
5、引物濃度一般為0.1 ～0.5 μmol/L。
6、反應溫度
a. 變性溫度和時間95℃，30s。
b. 退火溫度和時間 低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃。
c. 延伸溫度和時間72℃，1 min/kb(10 kb內）。
d. Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7、循環次數：一般為25～30次。循環數決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低，可增加循環數以便達到有效的 擴增量。但循環數并不是可以無限增加的。一般循環數為30個左右，循環數超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產物的量不再隨循環數的增加而增加，出現了所謂的“平臺期”。