PCR擴增擴增曲線階段簡述

      PCR擴增過程中，每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度。隨著反應循環次數的不斷增加，所擴增的目的基因片段呈指數規律增長，反應中產生的熒光信號強度與PCR產物的數量呈正比。儀器實時檢測和采集的熒光信號，隨著時間和循環數的不斷增加，產生一條反映實時熒光信號強度變化的曲線，稱為擴增曲線。正常狀態擴增曲線：正常PCR擴增曲線呈“S”型，分為基線期、指數期、線性期、平臺期。擴增曲線良好的指標是曲線拐點清楚，擴增曲線整體平性好，基線平上揚現象。

1、基線期

PCR起始時，剛開始前幾個循環的熒光信號還沒有發生變化，接近一條直線，將其稱之為基線，一般是3-15個循環。在基線期內，擴增的熒光信號被背景熒光信號所掩蓋，無法判斷PCR產物量的變化。

2、指數期

擴增的熒光信號高于背景熒光信號，擴增曲線起峰，開始進入指數期。在指數期內，每個循環積聚的產物準確加倍（假定100%反應效率）。該階段的PCR反應具有高度特異性和精 確度。因為所有試劑均充足，反應的動力學推動反應有利于擴增子加倍，所以產物出現指數級擴增。只有在這個階段，Cq值與初始模板量的對數之間存在線性關系，所以在此階段進行定量分析合適。

3、線性期（高變異性）

隨著PCR反應體系各成分的消耗，其中的一種或者多種成分限制反應，導致反應開始減緩，并且每個循環的PCR產物不再加倍，該階段不再是指數級擴增。

4、平臺期

反應停止，不再產生更多產物，并且如果放置時間夠長，PCR產物將開始降解。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每支試管或每個反應將在不同的時間點進入平臺期，zui 終的產物含量也各不相同。

由于線性期和平臺期的擴增產物已不再呈指數級的增加，PCR的產物量與初始模板量之間沒有線性關系，所以也不能通過這兩個階段的PCR產物量計算出初始模板量。想要知道初始模板量的多少，還要依賴指數期的Cq值進行計算。 

理論上，PCR每個循環后擴增產物量即增加一倍，擴增曲線應表現為熒光值隨著循環數增加而不斷上升。

實際上，擴增曲線的熒光值并不會隨著循環數的增加而無限上升。這是由于PCR擴增進行到一定階段，反應體系中的原料發生消耗和變性，如dNTP和酶等原料相對于模板減少，同時酶活性逐漸達到飽和；引物二聚體和反應亞產物（如焦磷酸）的產生也會抑制擴增反應；引物和已擴增的DNA片段間的競爭等都會導致PCR的擴增效率逐步降低，直至為0。因此，擴增曲線表現為擴增到一定的循環數后，熒光值不再隨著循環數發生變化，而是保持平坦，出現平臺期。